Archief - Biotechnologie : Miniprep + gelelectrofrese

Het archief is een bevroren moment uit een vorige versie van dit forum, met andere regels en andere bazen. Deze posts weerspiegelen op geen enkele manier onze huidige ideeën, waarden of wereldbeelden en zijn op sommige plaatsen gecensureerd wegens ontoelaatbaar. Veel zijn in een andere tijdsgeest gemaakt, al dan niet ironisch - zoals in het ironische subforum Off-Topic - en zouden op dit moment niet meer gepost (mogen) worden. Toch bieden we dit archief nog graag aan als informatiedatabank en naslagwerk. Lees er hier meer over of start een gesprek met anderen.
B

Black-Sheep

Legacy Member
Ik heb dus een miniprep uitgevoegd om plasmide dna te isoleren uit mijn E.Coli's.
Nadien heb ik dan met een restrictie enzym het dna geknipt en op gel gezet, en gekleurd met Ethidium bromide .
Tot daar gaat alles goed :)

Maar kan krijg ik het volgende resultaat op mijn gel , 4 bandjes , ik verwacht er maar 2 eigenlijk , maar ja het eerste bandje is waarschijnlijk nog genomisch dna of plasmide dna dat niet geknipt werd , het tweede bandje is het plasmide dna , derde bandje is mijn pcr product dat in mijn plasmide zat en dan heb ik zo een wazig difuus bandje van ongeveer 100 bp en dat weet ik dus niet wat het zou kunnen zijn .
Primer dimeren al zeker niet want heb geen PCR gedaan :) dus ja als iemand weet wat het is :p laat maar horen eh ;)
k

klootvis

Legacy Member
Wat voor gelelektroforese heb je gebruikt ?
- denaturerende gradient gel electrophorese
- temperature gradient gel electrophorese
- gewone gel electrophorese

Ik denk momenteel even aan het het geval van een (T-)RFLP waarbij je te kloneren fragment achteraan een lange GC-sequentie heeft (GC-klem) en die in een gel met een gradient aan denaturerend agens geplaatst wordt. Indien deze GC-klem niet lang genoeg is, kan het gebeuren dat bij verhoogde concentratie aan denaturerende agens (kijk eens of je geen formaldehyde ofzo gebruikt) je 2 strands niet meer aan elkaar gehouden worden door deze GC-klem. Gevolg: het dubbel aantal bandjes dan gewoonlijk.
Probeer dan eens wat lagere stringency condities aan te leggen: verlaag uw concentratie formaldehyde

Schematisch
Code: 
GC
CG
GC
CG                 GCGC----------------
||                    
||    ==>                   CGCG ---------------
||
||

Verder zijn er ook gevallen bekend waarbij toevoegen van ethidiumbromide resulteert in 2 soorten ethidiumbromide-DNA-complexen die dus ook verschillende electroforetische mobiliteiten hebben.
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=307045&tools=bot
Als dit het probleem zou zijn, kun je misschien overwegen om zelf een probe te designen van jouw targetsequentie die je dan labelt met één of andere signaalsequentie (fluorescent, radiographisch, chromofoor). Waar die probe dat hybridiseert, dat is het stukje DNA waar jij naar opzoek bent


Persoonlijk is Cel- en genbiotechnologie niet mijn specialisatie, dus als er hier andere cel- en genbio-irs/ biochemici zitten, voel u vrij mij te verbeteren.:p
s

sh0s

Legacy Member
diffuse band op eind van je gel? => rest van je ladingsbuffer en andere brol

:) nuja dan zou je waarschijnlijk ni weten dat het 100bp is

anders eens een Western Blot uitvoeren als je antlichamen hebt tegenover je gen.
k

klootvis

Legacy Member
sh0aLa zei:
anders eens een Western Blot uitvoeren als je antlichamen hebt tegenover je gen.
Klik om te vergroten...

Heb ik ook al gesuggereerd, maar dat is misschien iets te duur voor de schaal waarop Black-Sheep werkt. Ik heb het toch nog nooit mogen uitvoeren :unsure:
s

sh0s

Legacy Member
hehe is niks spectaculair aan ze, blotten duurt een uurke in speciaal apparaat. Dan overnacht laten blokkern in PBS met magere melk poeder en dag enkele keren wassen (telkens 5min) en dan vloeistof met u antilichaam erop 1 uur laten incuberen, weer wassen, gemerkt antilichaam erop (1uur), weer wassen en dan detectie! => veel 'wacht' tijden dus :)
k

klootvis

Legacy Member
sh0aLa zei:
hehe is niks spectaculair aan ze, blotten duurt een uurke in speciaal apparaat. Dan overnacht laten blokkern in PBS met magere melk poeder en dag enkele keren wassen (telkens 5min) en dan vloeistof met u antilichaam erop 1 uur laten incuberen, weer wassen, gemerkt antilichaam erop (1uur), weer wassen en dan detectie! => veel 'wacht' tijden dus :)
Klik om te vergroten...

ahzo :) ja, ik wist dat het spektakelgehalte niet bijster hoog lag, maar ik dacht dat het blotten van uw probe nogal duur was (om een probe/targetsequentie/antilichaam aan te maken dat specifiek genoeg is). Leuk dat het niet zo blijkt te zijn :niceone:
Enfin, hopelijk is de threadstarter er al uit ...
B

Black-Sheep

Legacy Member
Ik wou gewoon misschien weten of iemand een gedacht zou hebben wat het zou zijn :p , maar het is niets ;) , zal het is maandag vragen aan mijn collega studenten ;)

En ja ik weet wel met prode en dan southern blot :p want ik werk met DNA :p :p :p westernblot is voor eiwitten dacht ik ;)
Het idd zeer goed idee zou zijn en daarna met een antilichaam op die probe :) , maar is nogal duur .

Dank u voor de mensen die er allemaal de moeite hebben gegeven om er over na te denken en te posten ;) , ik zal maandagavond posten wat mijn collegas denken dat het is :)
C

Conqie

Legacy Member
Black-Sheep zei:
Ik heb dus een miniprep uitgevoegd om plasmide dna te isoleren uit mijn E.Coli's.
Nadien heb ik dan met een restrictie enzym het dna geknipt en op gel gezet, en gekleurd met Ethidium bromide .
Tot daar gaat alles goed :)

Maar kan krijg ik het volgende resultaat op mijn gel , 4 bandjes , ik verwacht er maar 2 eigenlijk , maar ja het eerste bandje is waarschijnlijk nog genomisch dna of plasmide dna dat niet geknipt werd , het tweede bandje is het plasmide dna , derde bandje is mijn pcr product dat in mijn plasmide zat en dan heb ik zo een wazig difuus bandje van ongeveer 100 bp en dat weet ik dus niet wat het zou kunnen zijn .
Primer dimeren al zeker niet want heb geen PCR gedaan :) dus ja als iemand weet wat het is :p laat maar horen eh ;)
Klik om te vergroten...

Ik denk dat ik hier een cursus van heb, ik zal later is kijken mocht er iets in staan
K

Kepa

Legacy Member
sh0aLa zei:
hehe is niks spectaculair aan ze, blotten duurt een uurke in speciaal apparaat. Dan overnacht laten blokkern in PBS met magere melk poeder en dag enkele keren wassen (telkens 5min) en dan vloeistof met u antilichaam erop 1 uur laten incuberen, weer wassen, gemerkt antilichaam erop (1uur), weer wassen en dan detectie! => veel 'wacht' tijden dus :)
Klik om te vergroten...
geeft vrij ambetante labo's als ge het leert... 10m prullen, dan een uur in de cafetaria zitten, dan weer 10m prullen en terug naar de caf.
B

Black-Sheep

Legacy Member
Ik weet het wat het is eh :p , het wazig bandje op het einde van de gel is dus een RNASE bandje .
J

Jezeke

Legacy Member
Black-Sheep zei:
Ik weet het wat het is eh :p , het wazig bandje op het einde van de gel is dus een RNASE bandje .
Klik om te vergroten...

kleurt EtBr ook eiwitten? kdacht dat da alleen maar RNA en DNA kon merken
D

DickY

Legacy Member
Black-Sheep zei:
Maar kan krijg ik het volgende resultaat op mijn gel , 4 bandjes , ik verwacht er maar 2 eigenlijk , maar ja het eerste bandje is waarschijnlijk nog genomisch dna of plasmide dna dat niet geknipt werd , het tweede bandje is het plasmide dna , derde bandje is mijn pcr product dat in mijn plasmide zat en dan heb ik zo een wazig difuus bandje van ongeveer 100 bp en dat weet ik dus niet wat het zou kunnen zijn .
Primer dimeren al zeker niet want heb geen PCR gedaan :) dus ja als iemand weet wat het is :p laat maar horen eh ;)
Klik om te vergroten...

Genomisch DNA na een miniprep krijg je enkel als je de lyse van de E.coli cellen te lang hebt laten duren. De lyse stap moet kort zijn, max. paar minuten, duurt die langer, dan kan genomisch DNA ook in oplossing komen.

Niet-geknipt plasmide kan een extra band opleveren, maar als je uw restrictie enzym juist gekozen hebt, zou bv. standaard 100 ng op uurtje geknipt moeten zijn. (natuurlijk wel allemaal afhankelijk van de grootte en zuiverheid van plasmide tesamen met de activiteit, buffer en hoeveelheid van het enzym)

Maar het blijkt dat de juiste band (het gecloneerde fragment) in uw plasmide zit. Maar dat difuus bandje blijkt een contaminant te zijn.

Heb je positieve en negatieve controle erbij gedaan? Dus lege plasmide en een plasmide met een ander fragment in? Zou al meer informatie geven over de mogelijke fout. :)

Mijn raad: doe PCR op je miniprep, blijkt band van goede lengte aanwezig te zijn, laten sequeneren (plasmide of PCR), zoniet, doe opnief je clonering doen. :)
E

ElBramo

Legacy Member
Een Western blot? Bestaat dat ook? Ik heb alleen nog maar gehoord van een Southern Blot... Maar ik volg dan ook geen biotech.
B

Black-Sheep

Legacy Member
Jezeke zei:
kleurt EtBr ook eiwitten? kdacht dat da alleen maar RNA en DNA kon merken
Klik om te vergroten...

Mja vond dat ook bizar maar dien prof zij dat dus :p ja zullen we dat maar aannemen zeker. Ofwel is het gewoon RNA resten maar ja vind ik wel bizar want heb het staal behandeld met RNAse dus ja ,dunno.
Wou het gewoon weten uit nieuwsgierigheid dus niet dat het van levensbelang is ofzo

DickY zei:
Genomisch DNA na een miniprep krijg je enkel als je de lyse van de E.coli cellen te lang hebt laten duren. De lyse stap moet kort zijn, max. paar minuten, duurt die langer, dan kan genomisch DNA ook in oplossing komen.

Niet-geknipt plasmide kan een extra band opleveren, maar als je uw restrictie enzym juist gekozen hebt, zou bv. standaard 100 ng op uurtje geknipt moeten zijn. (natuurlijk wel allemaal afhankelijk van de grootte en zuiverheid van plasmide tesamen met de activiteit, buffer en hoeveelheid van het enzym)

Maar het blijkt dat de juiste band (het gecloneerde fragment) in uw plasmide zit. Maar dat difuus bandje blijkt een contaminant te zijn.

Heb je positieve en negatieve controle erbij gedaan? Dus lege plasmide en een plasmide met een ander fragment in? Zou al meer informatie geven over de mogelijke fout. :)

Mijn raad: doe PCR op je miniprep, blijkt band van goede lengte aanwezig te zijn, laten sequeneren (plasmide of PCR), zoniet, doe opnief je clonering doen. :)
Klik om te vergroten...

Dank u voor de raad zal het onthouden als ik later dat opnieuw moet doen , was gewoon op school van die fantastische experimenten (klasikaal dan nog wel) :p dat altijd in het 100 lopen ;)
Meestal is die restrictie enzyme al 100 keer ontdooit geweest en is die zijn activiteit dan ook niet meer van de beste , enzovoort ;) ......

ElBramo zei:
Een Western blot? Bestaat dat ook? Ik heb alleen nog maar gehoord van een Southern Blot... Maar ik volg dan ook geen biotech.
Klik om te vergroten...

Western blot is overbrengen van eiwitten van u gel naar u membraan en daarna detecteren met anti-lichaam.
Southern blot is overbrengen van DNA van u gel naar u membraan en daarna detecteren met een DNA-gemerkte-probe.
Nothern blot is overbrengen van RNA van u gel naar u membraan en daarna detecteren met RNA of DNA-gemerkte-probe.

(denk toch dat just is :p verbeter mij als ik fout zit )

En Southern blot schrijft ge met een hoordletter de rest niet , nen zekere Edwin Southern vond dat plezant om dat naar zijn eigen te noemen :) .
En de andere zeveraars natuurlijk met nothern en western afgekomen , humor van wetenschappers :rofl:
K

Kowlier

Legacy Member
interesante shit, welke richting hebt ge hiervoor gevolgd? ik volg nu bio ingenieur en hoop later ook met dna te werken. is het enige dak mij echt interesseerde, genen enzo.
H

Hellrabbit

Legacy Member
volg dan later de master cel-&gentechnologie en ge zult da nog wel genoeg te zien krijgen :)
D

DickY

Legacy Member
Hellrabbit zei:
volg dan later de master cel-&gentechnologie en ge zult da nog wel genoeg te zien krijgen :)
Klik om te vergroten...

aan die mannen (en vrouwen) geef ik practica :)

allemaal gebuisd :D
Het archief is een bevroren moment uit een vorige versie van dit forum, met andere regels en andere bazen. Deze posts weerspiegelen op geen enkele manier onze huidige ideeën, waarden of wereldbeelden en zijn op sommige plaatsen gecensureerd wegens ontoelaatbaar. Veel zijn in een andere tijdsgeest gemaakt, al dan niet ironisch - zoals in het ironische subforum Off-Topic - en zouden op dit moment niet meer gepost (mogen) worden. Toch bieden we dit archief nog graag aan als informatiedatabank en naslagwerk. Lees er hier meer over of start een gesprek met anderen.
Terug
Bovenaan